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免疫沉淀试剂盒(Protein A/G琼脂糖)图片
产品货号:
GS4780
中文名称:
免疫沉淀试剂盒(Protein A/G琼脂糖)
英文名称:
Immunoprecipitation Kit,Protein A/G Plus Agarose
产品规格:
20次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
免疫沉淀可以通过特异性抗体和结合抗体的基质,从复杂的蛋白混合物中特异性的纯化蛋白质,然后可以通过离心从混合物中分离出经特异性抗体结合蛋白的基质。本试剂盒使用的基质是琼脂糖结合Protein A/G Plus。IP之后是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),IP常用于各种应用,如测量蛋白质抗原的分子量,研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用,测定特异性酶活性,监测蛋白质表达后的修饰,确定蛋白质的存在和数量等。IP技术还能够检测罕见的蛋白质,因为IP可以将其浓缩至高达10000倍,否则一般方法难以检测。


组分规格
10×裂解缓冲液10mL
PMSF0.6mL
10×IP缓冲液50mL
10% SDS5mL
5M NaCL10mL
Protein A/G Plus琼脂糖0.4mL
20×PBS20mL
1×上样缓冲液1mL
柱、管、盖20套

保存:Protein A/G Plus琼脂糖需要在4℃保存,不可冻存。PMSF和1×上样缓冲液需要在-20℃保存,其他产品保存在室温即可,保质期24个月。


  • 准备:加入18μL(指Agarose树脂体积,若加混悬液需加36μL) Protein A/G Plus琼脂糖,到含有过滤片的柱子中,去掉盖子(不要丢弃盖子,将在第10步骤使用),加入700μL的1×PBS洗涤琼脂糖,低速离心,洗四次后琼脂糖即可使用。
  • 在5×106~1×107细胞培养物中,在4℃下以800rpm离心3min,收集细胞。去除上清并用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次。每次洗涤时以800rpm旋转3min。完全去除PBS并保留细胞沉淀。每100mg细胞沉淀加入1mL用双蒸水稀释后的1×裂解缓冲液,漩涡搅拌,用玻璃匀浆器匀浆30~50次或15%超声处理30sec,间隔1min,重复操作3次(超声功率及时间应根据不同仪器型号及样品性质进行适当调节,防止局部过热损坏超声器,影响破碎效果)。然后以12000rpm离心5min,收集上清液作为细胞裂解物。
  • 在新的微量离心管中加入0.7mL细胞裂解物,7μL PMSF和1μg的纯化抗体。
  • 在平台上4℃孵育1h至过夜。
  • 孵育后,将细胞裂解物移到装有洗涤过的Protein A/G Plus琼脂糖柱中。
  • 在平台上4℃孵育2h至过夜。
  • 将每个柱子中插入转移到提供的2mL的新微量离心管中。
  • 4℃,12000rpm离心旋转30sec。
  • 去掉上清,用700μL 1×IP缓冲液洗涤沉淀琼脂糖珠子6次,然后用700μL 0.1×IP缓冲液清洗珠子1~2次,以12000rpm离心柱子30sec。
  • 加入40~50μL 1×上样缓冲液,轻轻混合珠子(无涡旋)。
  • 用盖子密封柱子。
  • 在95℃加热5min,用薄纸或滤纸吸干盖子周围的水。
  • 打开柱盖,将柱子插入到新的微量离心管中,以12000rpm离心30sec,洗脱的免疫沉淀物可用于SDS-PAGE。



  • 1×裂解缓冲液可用于大多数细胞裂解过程(如果需要,可向其加入200:1比例的10% SDS)。
  • 裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂(如PMSF,抑肽酶)是至关重要的。
  • 在处理非特异性结合时,洗涤的次数和类型非常重要。
  • 当需要彻底清除SDS时,可以用1×PBS代替0.1×IP缓冲液。
  • 为了减少非目的细胞蛋白与Protein A/G Plus琼脂糖的非特异性吸附质,预先清除非特异性吸附的步骤非常重要。
    • 加入18μL Protein A/G Plus琼脂糖悬浮液(可以加入1μg对照IgG)到细胞提取液中。
    • 将样品转移到微量离心管中,摇床4℃孵育1h。
    • 以12000rpm离心30sec将琼脂糖珠粒沉淀,并将上清液收集到干净的管中。
    • 样品现已通过预先清除,可以进行免疫沉淀。

  • 当观察到蛋白质的非特异性吸附时,有必要通过如下表格中加入盐或SDS的方法,改变洗涤方案,提高洗涤条件的严苛性。
    Option 1Option 2Option 3
    First 2 Washes1×IP缓冲液/0.5M NaCl1×IP缓冲液/0.5M NaCl/0.1% SDS1×IP缓冲液/0.1%SDS
    Next 4 Washes1×IP缓冲液1×IP缓冲液1×IP缓冲液
    Last 1 Washes0.1×IP缓冲液/PBS0.1×IP缓冲液/PBS0.1×IP缓冲液/PBS



  • 没有信号或信号很弱
    • 为了降低样品在制备过程中抗原降解的可能性,加入蛋白酶抑制剂。
    • 增加抗体的浓度,延长孵育时间。
    • 缩短洗涤时间,使用温和的洗涤缓冲液(不含洗涤剂)。
    • 延长Protein A/G Plus琼脂糖的孵育时间(过夜)。
    • 增加凝胶电泳的蛋白上样量。
    • 检查印迹有效性。更改印迹条件,缓冲液等。
    • 检查检测系统或延长检测时间。

  • 背景太大
    • 增加预清除步骤的吸收倍数,去除所有非目的蛋白与Protein A/G Plus琼脂糖的非特异性吸附。
    • 增加抗体-Protein A/G Plus琼脂糖复合物的洗涤时间,或增加洗涤的严苛性。
    • 避免与膜接触,使用干净的设备,新缓冲液和新膜。
    • 稀释样品中的蛋白质浓度,降低抗体浓度。



Protein A和Protein G和Protein A/G对不同抗体的结合能力
种属亚型Protein A结合力Protein G结合力Protein A/G结合力
HumanIgAvariable++
IgD
IgE
IgG1++++++++++++
IgG2++++++++++++
IgG3++++++++
IgG4++++++++++++
IgGMvariable++
Avian egg yolkIgY
Cow++++++++++
Dog++++++++++
Goat++++++++
Guinea pigIgG1++++++++++
IgG2++++++++++
Hamster+++
HorseTotal IgG++++++++++
Koala+
Liama+
MouseIgG1+++++++
IgG2a++++++++++++
IgG2b+++++++++
IgG3++++++++
IgMvariable
Monkey(rhesus)++++++++++++
Pig++++++++++
RabbitTotal IgG+++++++++++
RatIgG1+++
IgG2a++++++++
IgG2b++++
IgG3+++++
SheepTotal IgG+/-++++

++++:结合能力强
++:结合能力中等
+:结合能力弱
—:没有结合能力
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