产品货号:
GS4780
中文名称:
免疫沉淀试剂盒(Protein A/G琼脂糖)
英文名称:
Immunoprecipitation Kit,Protein A/G Plus Agarose
产品规格:
20次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
免疫沉淀可以通过特异性抗体和结合抗体的基质,从复杂的蛋白混合物中特异性的纯化蛋白质,然后可以通过离心从混合物中分离出经特异性抗体结合蛋白的基质。本试剂盒使用的基质是琼脂糖结合Protein A/G Plus。IP之后是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),IP常用于各种应用,如测量蛋白质抗原的分子量,研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用,测定特异性酶活性,监测蛋白质表达后的修饰,确定蛋白质的存在和数量等。IP技术还能够检测罕见的蛋白质,因为IP可以将其浓缩至高达10000倍,否则一般方法难以检测。
保存:Protein A/G Plus琼脂糖需要在4℃保存,不可冻存。PMSF和1×上样缓冲液需要在-20℃保存,其他产品保存在室温即可,保质期24个月。
Protein A和Protein G和Protein A/G对不同抗体的结合能力
++++:结合能力强
++:结合能力中等
+:结合能力弱
—:没有结合能力
相关搜索:免疫沉淀试剂盒(Protein A/G琼脂糖),免疫沉淀试剂盒,IP试剂盒,Protein A/G琼脂糖免疫沉淀试剂盒,Protein A/G免疫沉淀试剂盒,,Immunoprecipitation Kit,Protein A/G Plus Agarose
组分 | 规格 |
10×裂解缓冲液 | 10mL |
PMSF | 0.6mL |
10×IP缓冲液 | 50mL |
10% SDS | 5mL |
5M NaCL | 10mL |
Protein A/G Plus琼脂糖 | 0.4mL |
20×PBS | 20mL |
1×上样缓冲液 | 1mL |
柱、管、盖 | 20套 |
保存:Protein A/G Plus琼脂糖需要在4℃保存,不可冻存。PMSF和1×上样缓冲液需要在-20℃保存,其他产品保存在室温即可,保质期24个月。
- 准备:加入18μL(指Agarose树脂体积,若加混悬液需加36μL) Protein A/G Plus琼脂糖,到含有过滤片的柱子中,去掉盖子(不要丢弃盖子,将在第10步骤使用),加入700μL的1×PBS洗涤琼脂糖,低速离心,洗四次后琼脂糖即可使用。
- 在5×106~1×107细胞培养物中,在4℃下以800rpm离心3min,收集细胞。去除上清并用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次。每次洗涤时以800rpm旋转3min。完全去除PBS并保留细胞沉淀。每100mg细胞沉淀加入1mL用双蒸水稀释后的1×裂解缓冲液,漩涡搅拌,用玻璃匀浆器匀浆30~50次或15%超声处理30sec,间隔1min,重复操作3次(超声功率及时间应根据不同仪器型号及样品性质进行适当调节,防止局部过热损坏超声器,影响破碎效果)。然后以12000rpm离心5min,收集上清液作为细胞裂解物。
- 在新的微量离心管中加入0.7mL细胞裂解物,7μL PMSF和1μg的纯化抗体。
- 在平台上4℃孵育1h至过夜。
- 孵育后,将细胞裂解物移到装有洗涤过的Protein A/G Plus琼脂糖柱中。
- 在平台上4℃孵育2h至过夜。
- 将每个柱子中插入转移到提供的2mL的新微量离心管中。
- 4℃,12000rpm离心旋转30sec。
- 去掉上清,用700μL 1×IP缓冲液洗涤沉淀琼脂糖珠子6次,然后用700μL 0.1×IP缓冲液清洗珠子1~2次,以12000rpm离心柱子30sec。
- 加入40~50μL 1×上样缓冲液,轻轻混合珠子(无涡旋)。
- 用盖子密封柱子。
- 在95℃加热5min,用薄纸或滤纸吸干盖子周围的水。
- 打开柱盖,将柱子插入到新的微量离心管中,以12000rpm离心30sec,洗脱的免疫沉淀物可用于SDS-PAGE。
- 1×裂解缓冲液可用于大多数细胞裂解过程(如果需要,可向其加入200:1比例的10% SDS)。
- 裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂(如PMSF,抑肽酶)是至关重要的。
- 在处理非特异性结合时,洗涤的次数和类型非常重要。
- 当需要彻底清除SDS时,可以用1×PBS代替0.1×IP缓冲液。
- 为了减少非目的细胞蛋白与Protein A/G Plus琼脂糖的非特异性吸附质,预先清除非特异性吸附的步骤非常重要。
- 加入18μL Protein A/G Plus琼脂糖悬浮液(可以加入1μg对照IgG)到细胞提取液中。
- 将样品转移到微量离心管中,摇床4℃孵育1h。
- 以12000rpm离心30sec将琼脂糖珠粒沉淀,并将上清液收集到干净的管中。
- 样品现已通过预先清除,可以进行免疫沉淀。
- 加入18μL Protein A/G Plus琼脂糖悬浮液(可以加入1μg对照IgG)到细胞提取液中。
- 当观察到蛋白质的非特异性吸附时,有必要通过如下表格中加入盐或SDS的方法,改变洗涤方案,提高洗涤条件的严苛性。
Option 1 Option 2 Option 3 First 2 Washes 1×IP缓冲液/0.5M NaCl 1×IP缓冲液/0.5M NaCl/0.1% SDS 1×IP缓冲液/0.1%SDS Next 4 Washes 1×IP缓冲液 1×IP缓冲液 1×IP缓冲液 Last 1 Washes 0.1×IP缓冲液/PBS 0.1×IP缓冲液/PBS 0.1×IP缓冲液/PBS
- 没有信号或信号很弱
- 为了降低样品在制备过程中抗原降解的可能性,加入蛋白酶抑制剂。
- 增加抗体的浓度,延长孵育时间。
- 缩短洗涤时间,使用温和的洗涤缓冲液(不含洗涤剂)。
- 延长Protein A/G Plus琼脂糖的孵育时间(过夜)。
- 增加凝胶电泳的蛋白上样量。
- 检查印迹有效性。更改印迹条件,缓冲液等。
- 检查检测系统或延长检测时间。
- 为了降低样品在制备过程中抗原降解的可能性,加入蛋白酶抑制剂。
- 背景太大
- 增加预清除步骤的吸收倍数,去除所有非目的蛋白与Protein A/G Plus琼脂糖的非特异性吸附。
- 增加抗体-Protein A/G Plus琼脂糖复合物的洗涤时间,或增加洗涤的严苛性。
- 避免与膜接触,使用干净的设备,新缓冲液和新膜。
- 稀释样品中的蛋白质浓度,降低抗体浓度。
- 增加预清除步骤的吸收倍数,去除所有非目的蛋白与Protein A/G Plus琼脂糖的非特异性吸附。
Protein A和Protein G和Protein A/G对不同抗体的结合能力
种属 | 亚型 | Protein A结合力 | Protein G结合力 | Protein A/G结合力 |
Human | IgA | variable | — | ++ |
IgD | — | — | — | |
IgE | — | — | — | |
IgG1 | ++++ | ++++ | ++++ | |
IgG2 | ++++ | ++++ | ++++ | |
IgG3 | — | ++++ | ++++ | |
IgG4 | ++++ | ++++ | ++++ | |
IgGM | variable | — | ++ | |
Avian egg yolk | IgY | — | — | — |
Cow | ++ | ++++ | ++++ | |
Dog | ++++ | ++ | ++++ | |
Goat | — | ++++ | ++++ | |
Guinea pig | IgG1 | ++++ | ++ | ++++ |
IgG2 | ++++ | ++ | ++++ | |
Hamster | + | ++ | ||
Horse | Total IgG | ++ | ++++ | ++++ |
Koala | — | + | ||
Liama | — | + | ||
Mouse | IgG1 | + | ++++ | ++ |
IgG2a | ++++ | ++++ | ++++ | |
IgG2b | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | ++ | +++ | +++ | |
IgM | variable | — | — | |
Monkey(rhesus) | ++++ | ++++ | ++++ | |
Pig | +++ | +++ | ++++ | |
Rabbit | Total IgG | ++++ | +++ | ++++ |
Rat | IgG1 | — | + | ++ |
IgG2a | — | ++++ | ++++ | |
IgG2b | — | ++ | ++ | |
IgG3 | + | ++ | ++ | |
Sheep | Total IgG | +/- | ++ | ++ |
++++:结合能力强
++:结合能力中等
+:结合能力弱
—:没有结合能力
相关搜索:免疫沉淀试剂盒(Protein A/G琼脂糖),免疫沉淀试剂盒,IP试剂盒,Protein A/G琼脂糖免疫沉淀试剂盒,Protein A/G免疫沉淀试剂盒,,Immunoprecipitation Kit,Protein A/G Plus Agarose